1 菌株的慨念分類

1.1、概念

標(biāo)準(zhǔn)菌株：即0代菌種，是指從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：從國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，即為標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株。

儲(chǔ)存菌株：儲(chǔ)存菌株通常從凍干或超低溫保存的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌株進(jìn)行制備。

工作菌株：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株或儲(chǔ)存菌株經(jīng)繼代培養(yǎng)后得到的菌株。工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株。

標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物：標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株、工作菌株的統(tǒng)稱。

商業(yè)派生菌株：與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)衍生物。

1.2、商業(yè)派生菌株

商業(yè)派生菌株是標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物，最常見的商業(yè)派生菌株有廣東環(huán)凱的定量工作菌株。在中國藥典2015版9203指導(dǎo)原則里面有提到“藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株"，也有關(guān)于可以使用合格的商品化菌株的描述“Cultures for use in compendial tests should be acquired from a national culture collection or a qualified secondary supplier"。隨著技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，微生物實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定、高效的需求，用于質(zhì)控的商業(yè)化定量工作菌株的廣泛應(yīng)用定是必然趨勢。

商業(yè)派生菌株要求相關(guān)特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效，除此之外，還有關(guān)鍵一點(diǎn)就是“可以溯源"。微生物"溯源"通常包含兩層意思，一是指程序、途徑合法有序，來源和去向清晰可控；另外是技術(shù)層面的佐證，比如株水平的鑒定識(shí)別等。這兩個(gè)層面互為補(bǔ)充支撐，以保證菌種準(zhǔn)確無誤、合法有效。

2 菌株的保存

2.1、 常用保存方法

短期保存：營養(yǎng)瓊脂斜面法 (4°C)

步驟：
? 將新鮮培養(yǎng)物劃線或穿刺接種于無菌營養(yǎng)瓊脂斜面。
? 于合適溫度（通常37°C）培養(yǎng)至良好生長（通常16-24小時(shí)）。
? 斜面長出新鮮菌苔后，旋緊試管蓋或用無菌膠塞密封（確保透氣）。
? 貼上標(biāo)簽（菌株編號(hào)、日期、操作人），置于4°C冰箱。

保存期： 1 - 3個(gè)月（因菌種差異極大）。

優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單、復(fù)蘇快。

缺點(diǎn)： 易污染、易變異、保存時(shí)間短、需頻繁傳代。

關(guān)鍵點(diǎn)： 使用新鮮培養(yǎng)物；密封防干涸；定期檢查存活狀態(tài)。

中長期保存：甘油冷凍管法

步驟：
? 制備50%無菌甘油溶液（用去離子水或生理鹽水配制，121°C滅菌15分鐘）。
? 取對(duì)數(shù)生長后期的新鮮肉湯培養(yǎng)物（OD~600~ ≈ 0.6 - 1.0）或適量無菌生理鹽水菌懸液。
? 將菌懸液與50%甘油溶液等體積混合（終甘油濃度~25%）。或直接將菌苔刮入含滅菌甘油的成品管（如下圖的環(huán)凱甘油保存管）中混勻。

? 分裝至無菌、預(yù)標(biāo)記好的冷凍管（如1.5ml或2ml Cryovial管）中（通常0.5 - 1ml/管），立即置于超低溫冰箱保存。

保存期： 1 - 10年或更長（視菌種而定）。

優(yōu)點(diǎn)： 保存時(shí)間長、操作相對(duì)簡單、遺傳穩(wěn)定性較好、復(fù)蘇率高。

缺點(diǎn)： 依賴超低溫C冰箱、復(fù)蘇需解凍。

關(guān)鍵點(diǎn)： 確保菌體處于對(duì)數(shù)生長期（活力最佳）；甘油濃度準(zhǔn)確（過高抑制，過低冰晶損傷）；混合均勻；快速冷凍（可先放-20°C 1-2小時(shí)再轉(zhuǎn)-80°C）；避免反復(fù)凍融。

長期保存：冷凍干燥法（凍干法）

步驟 (簡述)：
制備保護(hù)劑：常用脫脂牛奶、蔗糖、海藻糖等。
制備濃菌懸液：取新鮮培養(yǎng)的菌苔，懸浮于適量保護(hù)劑中（濃度約10⁸-10¹⁰CFU/ml）。
分裝：將菌懸液分裝至無菌凍干安瓿瓶中（0.2 - 0.5ml）。
預(yù)凍：將安瓿瓶置于-40°C至-80°C快速預(yù)凍。
冷凍干燥：將預(yù)凍好的樣品放入凍干機(jī)，在真空下升華除去水分（通常需數(shù)小時(shí)至數(shù)十小時(shí)）。
封口：凍干結(jié)束后，在真空或充氮?dú)鈼l件下用火焰熔封安瓿瓶。
儲(chǔ)存：將封口后的安瓿瓶置于4°C或-20°C避光干燥處長期保存。

保存期： 10 - 30年或更長。

優(yōu)點(diǎn)： 保存時(shí)間極長、遺傳穩(wěn)定性好、占用空間小、便于運(yùn)輸。

缺點(diǎn)： 設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、成本高、部分菌種復(fù)蘇率可能較低。

關(guān)鍵點(diǎn)： 保護(hù)劑選擇與滅菌；菌懸液濃度；預(yù)凍速度；凍干程序優(yōu)化；嚴(yán)格無菌操作；安瓿瓶封口質(zhì)量。

2.2、通用操作規(guī)范與注意事項(xiàng)

1. 無菌操作： 所有步驟必須在無菌條件下進(jìn)行（超凈工作臺(tái)/生物安全柜）。

2. 菌株?duì)顟B(tài)： 使用新鮮、對(duì)數(shù)生長期、純培養(yǎng)物進(jìn)行保存。保存前需確認(rèn)純度（鏡檢、平板劃線）。

3. 標(biāo)簽標(biāo)識(shí)：清晰標(biāo)注菌株編號(hào)、保存日期、保存人姓名、保存方法。
      使用防水、耐低溫的標(biāo)簽和記號(hào)筆。
      冷凍管標(biāo)簽應(yīng)能耐-80°C低溫。

4. 記錄管理： 建立詳細(xì)的菌種保存登記本或電子數(shù)據(jù)庫，記錄保存信息（菌株信息、保存方法、位置、數(shù)量、復(fù)蘇記錄等）。

5. 備份原則： 重要菌株應(yīng)至少采用兩種不同方法保存（如甘油管+凍干），并分置于不同地點(diǎn)（如同一冰箱不同層或不同冰箱），防止設(shè)備故障導(dǎo)致全部損失。

6. 避免反復(fù)凍融： 冷凍保存的菌株（甘油管、凍干粉、液氮管）一旦解凍復(fù)蘇，不得再次冷凍保存。應(yīng)重新從原代保存管取菌培養(yǎng)后進(jìn)行新一輪保存。

7. 定期檢查：
      4°C斜面：每周檢查有無污染、干涸。
      -80°C冰箱：記錄溫度，定期除霜維護(hù)。每年抽樣復(fù)蘇檢查代表性菌株。